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Hi, 大家好,
我遇到了一個 cloning 問題。
我現在正在做 GST-fused protein。
Insert 的部分，
首先我利用 SOEing PCR 的方式將 GST 和要表現的基因連接在一起後，
利用 HindIII 反應其中一端，
並利用 T4 DNA polynucleotide kinase (PNK) 反應另一端加上 phosphate group。
得到一具有一端為 sticky end (HindIII) 和一端為 Blunt end 的產物。
另外，我將載體以 StuI (blunt end) 和 HindIII 反應後，
以 CIP 去掉端點的 phosphate group。
接著，我將 vector 和 insert 以 10 fmole 和 30 fmole 的量混在一起，
以 Ligase 連接，並轉入 TOP10 中。
現在我遇到的問題就是，我所有的 clone 都是反接的。
用 colony PCR 的方式確認過百個 clone，
只要用 vector 兩端的 primer 均可找到目標大小的片段，
但用 gene primer + vector primer （有方向性的）就沒有 PCR 產物。
然後我隨機挑了 12 個 colonies 抽取質體，以 vector 上的序列引子定序，
序列是正確的，但所有 insert 都是反接的。
請問有人遇過這個問題嗎？如果可以請告訴我怎麼解決的。
還是有人知道可能發生的原因？
感激不盡～
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.79.42
primer 是確定沒有錯方向的。這部分也已經檢查過了。
這我也認為是有可能的。
事實上我 His-tag fuse 相同基因是可以表現的。
但我用 his-tag 驅動的蛋白質表現量相當大，沒有變成 inclusion body,
加入誘導劑 IPTG 後生長也沒有明顯減慢。
這兩種表現只有 tag 不同。我也切相同的切位。
訂序有 HindIII 的切位沒錯，但 HindIII: AAGCTT, StuI: AGGCCT，
看起來就算反接可能也能切開。
其實這件事情我做過了。兩頭 blunt end 連接（全部接再 StuI）還是同向的。
不知道差別會在哪邊。
沒有多 base。就是 MCS-HindIII-gene insert-半個 StuI-HindIII 5 個 base
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