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rna轉cdna步驟 在 擴增和檢測核糖核酸（RNA）片段的方法 - 智財技轉處 的推薦與評價
此法包括兩步驟：以獨特的方法將RNA轉成cDNA，再以TOP-PCR複製cDNA再定序。 技術優勢. 可偵測或擴增微量的細胞外的游離RNA與囊泡內的RNA， ... ... <看更多>
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此法包括兩步驟：以獨特的方法將RNA轉成cDNA，再以TOP-PCR複製cDNA再定序。 技術優勢. 可偵測或擴增微量的細胞外的游離RNA與囊泡內的RNA， ... ... <看更多>
rna轉cdna步驟 在 [求救] 如何提升RNA提取質量- 看板Biotech - 批踢踢實業坊 的推薦與評價
大家好，目前提取RNA遇到一個瓶頸，想請版友指點迷津：
收集RNA的步驟是使用Trizol and Chloroform 去提取，我的樣品條件會同時重複8組，每
一組樣品下25萬顆細胞，之前都能順利收到足夠質量的RNA進行後續轉cDNA步驟，但最近
出現相同手法但是總質量都過低情況。
每次收集下來的RNA我都固定溶於10ul DEPC water，所有樣品固定使用1ml Trizol進行提
取。
第一次失敗樣品總共重複8組，我想說過程可能不小心出錯，第二次保險起見，我樣品準
備了10組（提高細胞數量），並以相同提取方法再試一次，分析濃度後如下圖：
第三次我一樣準備10組樣品，此次改變一些手法，樣品使用冰的PBS進行清洗後（看能否
避免降解）再加入Trizol，加入Trizol後再使用刮棒進行刮除，接著把Trizol吸取到15ml
離心管，放置到冰浴上(希望能避免降解），接著再清洗第二組樣品，然後把離心管內的T
rizol再抽出來加入第二組樣品，重複步驟持續下去...
分析的濃度如下圖：
由於RNA轉成cDNA需要5ug，已連續3次出現整體RNA質量不足的情況，目前想不出哪些可能
原因造成此情況，想請版友不吝指教或者分享相關經驗。
謝謝 感激不盡
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 58.114.139.73
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1555941315.A.9F6.html
但是之前的組別只需要8組樣品就能收到，此次數量多2組又質量不足，實在想不透
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/22/2019 22:58:26
謝謝Q大，效期的部分明日會確認看看，東西移出操作台後，使用的器具跟桌面都有使用7
5% E
tOH/DEPC擦拭
謝謝J大，關於細胞數量部分，樣品處理前會使用光學顯微鏡觀察，細胞密度看起來跟以
前沒太大差異，先前8組樣品一起收下來的RNA約600-750ng/ul，總體積一樣回溶在10ul，
回溶後我都固定存放於-80冷凍2天再進行分析濃度，分析完後直接轉cDNA。
DEPC water、 Chloroform 、isopropanol都是室溫保存，但之前存放Trizol的冰箱故障
，不知道是否有影響？
分析濃度是以nanodrop，取出樣品1ul進行分析，分析前先以DEPC water當blank，所以之
前的濃度在分析完後剩下9ul，是足夠5ug進行後續cDNA步驟
分析的儀器如圖片，廠牌Microdigital
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:11:41
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:12:32
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:20:09
之前沒有刮耶，都是pipette沖一沖就好
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 01:07:15
T大，我是按照實驗步驟，細胞實驗是到合作實驗室進行，轉cDNA的步驟是依照對方給的
。我好像看到一線希望@@
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:16:52
目前沒步驟，印象是oligo dt 1ul 、10mM dNTP 1ul、總共5ug RNA、剩下不足體積
以DEPC water補滿，總體檢13ul。
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:21:16
J大，之前的方式是反覆吸取沖一沖，是可收到足夠量，直到出現第一次濃度過低後，我
第二次再重複一次也是如此，第三次使用刮棒重複刮個3-4次，刮棒都有去沾trizol再去
刮樣品表面
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 11:09:07
首先第一步是加入下列試劑
1ul Oligo dT
1ul 10mM dNTP
DEPC water(最後看差多少體積補足到13ul)
5ug的RNA
總體積:13ul
最後加入的試劑如下:
5x first strand reaction buffer: 4μl
0.1M DTT: 1μl
RNase out: 1μl
Super Script III (SS III): 1μl
總體積為20ul
再放進機器去跑
※ 編輯: forever430 (140.116.159.183), 04/23/2019 18:51:50
※ 編輯: forever430 (223.138.55.87), 04/24/2019 00:50:53
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